## 一、原理

Western Blot技术原理与Southern或Northern杂交方法相似，但采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，主要用于检测蛋白质，其“探针”是抗体，而“显色”则利用标记的二抗。首先，通过PAGE技术分离蛋白质样品，然后将其转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上。该固相载体通过非共价键的形式吸附蛋白质，可以保持电泳分离的多肽类型及其生物功能不变。首先将固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与特定抗体发生免疫反应，接着与酶或同位素标记的第二抗体反应，最终通过底物显色或放射自显影来检测电泳分离的特异性目的基因的蛋白表达水平。该技术广泛应用于蛋白质表达水平的检测，手段既包括定性又包括半定量，成为初步鉴定蛋白质最便捷亦最通用的方法。常用的显色方法有以下几种：放射自显影、底物化学发光（ECL）、底物荧光（ECF）以及底物DAB显色，其中底物化学发光ECL和底物DAB显色是最常见的方式。目前，使用底物化学发光ECL的文章较为普遍，购买现成的试剂盒并进行简单操作即可。以下是相关原理：使用HRP标记的二抗，反应底物为过氧化物和鲁米诺，如遇HRP会发光，从而使胶片曝光并洗出条带。

## 二、操作步骤

### (一) 配胶

1. 在配制胶前，需将玻璃板彻底清洗并用ddH2O冲洗，确保与胶接触的一面向下倾斜放置于干净纸巾上晾干。分离胶和浓缩胶可提前配好（除AP和TEMED外），过滤后储存在避光环境中，4℃下可存放至少一个月。在使用前需回温至室温，避免气泡产生。加入10%AP和TEMED即可调整浓度。若室温较低，可适当提高AP和TEMED的浓度。

2. 封胶步骤：将2/3分离胶灌注后立即封胶，对于胶浓度小于10%可使用0.1%的SDS封，若大于10%则用水饱和的异/丁醇或异/戊醇，亦可使用0.1%的SDS。封胶后不可移动，待胶完全凝固后倒掉封胶液，并使用清水和ddH2O彻底冲洗。

3. 关于浓缩胶的处理：在拔除梳子时应注意防止气泡进入梳孔，可用ddH2O冲洗胶孔以去除残胶。待胶凝后（约30分钟）即可上样，过长时间有助于胶结构的稳定。

### (二) 样品处理

1. 培养的细胞定性方法：培养液去除后用温PBS洗涤2-3遍，然后加入200-300μl的60-80℃ 1×loading buffer，接着在100℃加热1分钟。使用细胞刮刀收集细胞并在EB管中煮沸10分钟，期间轻微震荡2-3次。确保没有团块后，可用注射器降低粘度，待室温后上样。

2. 培养细胞定量方法：同样清洗并加入适量冰冷的裂解液后在冰上放置10-20分钟，用细胞刮刀收集细胞，然后超声处理。使用低温离心收集上清后定量。

3. 组织样本处理：针对心、肝、脾、肾等组织，可手动或电动快速匀浆，注意保持低温，之后也需离心收集上清并定量。

### (三) 电泳

在上样前应移除胶板下方的气泡，确保样品均匀，样品及Marker使用等体积的1×loading buffer。以初始电压45V进行稳流电泳，当电压达到65V时转为稳压电泳，直到目标蛋白移至胶下缘1cm以内结束。

### (四) 转膜

电泳结束前20分钟，需准备转移液和膜材料，湿转和干转的步骤也有所不同。使用适当的转移液，将浸泡膜、胶及滤纸分层放置，确保无气泡并仔细剪裁，最后通过电流实现蛋白的转移。

### (五) 封闭及杂交

膜需在PBST或TTBS中浸泡以去除多余的抗体时需小心处理，接下来进行一抗结合，洗涤后再进行二抗结合和洗涤。

### (六) 发光鉴定

使用HRP-ECL或AP-NBT/BICP发光方法进行检测，按比例调配发光液，在适当条件下观察显色后处理胶片并进行分析。

## 三、注意事项

若目的条带未出现或淡，建议对膜进行多次清洗，延长曝光时间，或提高封闭时间以增强信号。如使用强抗体可更多地进行二抗杂交。

尊龙凯时-人生就是博，致力于为生物医疗研究提供优质解决方案，提升科研效率，确保研究结果的有效性。希望本指南能助您在Western Blot的实验中取得成功，帮助您在学术和临床应用中实现更高的突破！