在生物医疗领域中，样本的采集和保存对于ELISA（酶联免疫吸附测定）的成功至关重要。各种体液（如血清）、分泌物（如唾液）及排泄物（如尿液、粪便）均可作为测定抗体或抗原的样本。其中，一些样本可直接进行检测（如血清、尿液），而另一些则需要经过预处理（如粪便和某些分泌物）。一般而言，ELISA检测多以血清作为检测样本。与血清相比，血浆中还含有纤维蛋白原和抗凝剂，因此在制备血浆样本时需使用抗凝剂，而血清样本则可通过自然凝固和血块收缩获得。除特殊情况外，医学检验中通常使用血清作为检测样本。在ELISA中，血浆和血清均可等效使用。

血清样本的采集需遵循常规操作，避免溶血现象，因为红细胞的溶解会释放出过氧化物酶活性物质，从而影响HRP标记的ELISA检测的特异性。血清样本宜在新鲜时进行检测。若样本受到细菌污染，可能会因菌体中的内源性HRP导致假阳性结果。此外，保存时间过长也会导致样本中的成分聚合，进而加深间接法ELISA中的背景。通常情况下，在5天内检测的血清样本可置于4℃保存，超过一周的样本则需冷冻保存。冷冻后的血清在解冻时可能会导致蛋白质不均匀分布，因此应轻缓混合并避免产生气泡。对于混浊或有沉淀的血清样本，需先离心或过滤，以确保检测结果的准确性。为了避免抗体效价下降，对于需要多次检测的血清样本，建议分装并冷冻保存。同时，从样本采集之时起，必须严格遵循无菌操作，可以适当添加防腐剂。

在准备ELISA试剂时，务必按照试剂盒说明书要求进行。使用的蒸馏水或去离子水需保持新鲜且具备高质量。自制的缓冲液需通过pH计测量校准。实验所需的试剂在使用前应与室温平衡，试剂盒中未使用的部分应及时放回冰箱保存，以保证其活性。

在ELISA过程中，加样步骤包括标本、酶结合物和底物的三次加样。加样时，应将样本加入试管底部，避免溅出或形成气泡。标本的加样一般使用微量加样器，并应每次更换吸嘴以防止交叉污染。同时，对于需要稀释的血清样本，可以在试管中按照规定比例稀释后再加样，或在板孔中加入稀释液后再加入血清，并在微型震荡器上震荡以确保混合均匀。在加酶结合物及底物时，可使用多道加液器，以提高加样效率。

ELISA检测中的抗原抗体反应一般需经过两次加样，确保反应完成。此过程称为温育（incubation），而不是孵育—适合于ELISA的固相免疫检测法，其反应发生在固体表面。在抗体包被的夹心法中，加入的标本中的抗原并不能均匀接触到固相抗体，只有紧邻孔壁的抗原有机会结合，这需要通过扩散实现平衡。因此，ELISA反应通常需要一定时间的温育。常用的温育温度包括4℃、室温、37℃和43℃，其中37℃为最适宜的温度，一般在该温度下抗原抗体反应经过1-2小时能够达到反应峰值。虽然提高温度可以加速反应，但通常不推荐超过43℃。在放射免疫检测中，4℃反应可更为彻底，但由于时间较长，在ELISA中并不常用。

在生物医疗检测中，确保操作规范和样本的准确性至关重要，只有这样才能够保证检测结果的可靠性，而尊龙凯时-人生就是博将持续为您提供专业而优质的服务。