细胞复苏的成败与冻存及复苏操作密切相关。上周，我们讨论了细胞冻存时易出现的错误，详细请参考《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将从复苏的角度出发，排查复苏过程中可能碰到的问题。

复苏步骤回顾

在开始之前，我们首先回顾一下细胞复苏的步骤：

1. 提前将水浴锅预热至37℃，并复温培养基，设置好离心机的转速。
2. 准备一个15ml离心管并加入适量培养基。
3. 取出冻存管，浸入水浴锅中，迅速摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 将细胞悬液缓慢滴入提前添加了培养基的离心管，进行1000rpm离心3分钟。
5. 弃上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，放入培养箱。

常见的复苏操作错误

以下是复苏过程中常见错误操作：

1. 运输过程中缺乏保冷措施：若液氮或冰箱距离水浴锅较远，没有做好保冷，细胞可能在运输途中开始融化。尤其是在夏季，冻存细胞应该放在干冰或冰盒上进行运输。
2. 不当接触冻存管：运输冻存管时避免用手触碰细胞部分或将其放进口袋，手的接触会导致管身局部温度升高，从而使细胞开始融化。应通过捏住管盖或将其放在容器中进行运输。
3. 错误的融化方式：不要用手捂热冻存管进行融化（搓热也不行），因为手心温度不足，可能导致细胞受热不均匀且降温速度过慢，造成细胞死亡。
4. 水浴时间控制不当：在水浴过程中如果不严格控制时间，简单将冻存管放入水中静置而不加以晃动，会影响细胞的复苏效果。务必遵循“快融”原则，建议在2分钟内融化细胞，水浴时间越长活率越低。理想的方法是捏住管盖，快速摇晃管身以促进细胞融化，切忌将冻存管静置在水中。
5. 水浴结束后残留冰块：如果在水浴结束时管内仍有较大冰块未融化，可能导致细胞死亡。冰块中的细胞升温慢而死亡，同时冰块会对已融化的细胞造成低温损伤。若2分钟融化时间不够，可以适当提升水浴温度至39℃，加快摇晃速度以使细胞更快融化。为避免污染，可以将冻存管放入一次性PE手套内进行水浴。
6. 未去除DMSO：细胞融化后不离心就直接加10倍培养基稀释，等待细胞贴壁后换液，虽然适用于易养活的贴壁细胞，但并非长久之计，悬浮细胞更是如此。DMSO对细胞有一定的毒性，某些细胞如HL-60对其敏感，因此在不确定细胞是否对DMSO敏感的情况下，离心去除上清是更为安全的选择。

以上内容是基于多年的经验总结，结合冻存过程，基本可以解决大部分复苏失败的问题。如果还有未提及的知识点，欢迎读者在评论区补充！

在细胞复苏的过程中，掌握以上要点将有助于提高成功率。记住，尊龙凯时-人生就是博，每一次实验都是一次新的冒险。希望大家在未来的实验工作中取得更好的成果！